Vào thời Thế Chiến II nổ ra ở Châu Âu vào năm 1939, Urey được công nhận là một chuyên gia về tách đồng vị. Cho đến nay, việc chia tách chỉ liên quan đến các yếu tố nhẹ. Năm 1939 và 1940, Urey xuất bản hai bài báo về việc tách các đồng vị nặng hơn, trong đó ông đề nghị tách ly tâm. Điều này đặt ra tầm quan trọng to lớn bởi sự suy đoán của Niels Bohr rằng uranium 235 có thể phân rã. Vì nó được coi là "rất nghi ngờ liệu một phản ứng dây chuyền có thể được thành lập mà không tách 235 khỏi phần còn lại của uranium", Urey bắt đầu nghiên cứu chuyên sâu về cách làm giàu urani có thể đạt được như thế nào. Ngoài việc ly thân bằng ly tâm, George Kistiakowsky cho rằng sự khuếch tán khí có thể là một phương pháp có thể. Một khả năng thứ ba là khuếch tán bằng nhiệt. Urey đã điều phối tất cả các nỗ lực nghiên cứu tách đồng vị, bao gồm cả nỗ lực để sản xuất nước nặng, có thể được sử dụng như là một người kiểm duyệt neutron trong lò phản ứng hạt nhân.

Tháng 5 năm 1941, Urey được bổ nhiệm vào Ủy ban Uranium, giám sát dự án uranium trong Ủy ban Nghiên cứu Quốc phòng Quốc gia (NDRC). Năm 1941, Urey và George B. Pegram đã lãnh đạo một phái bộ ngoại giao tới Anh để thiết lập hợp tác phát triển bom nguyên tử. Người Anh lạc quan về sự khuếch tán khí, nhưng rõ ràng là cả hai phương pháp khí và ly tâm đều phải đối mặt với những chướng ngại kỹ thuật ghê gớm. Vào tháng 5 năm 1943, khi dự án Manhattan giành được đà tăng trưởng. Urey trở thành người đứng đầu Phòng thí nghiệm Vật liệu thay thế Chiến tranh (SAM Laboratories) tại Columbia, chịu trách nhiệm cho quá trình làm giàu nước nặng và tất cả các quá trình làm giàu đồng vị, ngoại trừ quá trình điện từ của Ernest Lawrence.

Các báo cáo ban đầu về phương pháp ly tâm chỉ ra rằng nó không hiệu quả như dự đoán. Urey cho rằng nên sử dụng một hệ thống hiện đại phức tạp hơn nhưng lại phức tạp hơn thay vì phương pháp luồng thông tin trước đó. Vào tháng 11 năm 1941, những trở ngại kỹ thuật dường như đủ mạnh để quá trình này bị bỏ rơi. Các máy ly tâm ngược dòng được phát triển sau chiến tranh, và ngày nay là phương pháp được ưa chuộng ở nhiều nước.

Quá trình khuếch tán khí vẫn còn đáng khích lệ, mặc dù nó cũng đã có những trở ngại kỹ thuật để vượt qua. Vào cuối năm 1943, Urey đã có hơn 700 người làm việc cho ông trên sự khuếch tán khí. Quá trình này liên quan đến hàng trăm thác, trong đó có chứa urani hexafluoride ăn mòn lan truyền qua các rào chắn khí, dần dần được làm giàu ở mọi giai đoạn. Một vấn đề lớn là tìm kiếm con dấu thích hợp cho máy bơm, nhưng đến nay khó khăn lớn nhất nằm ở việc xây dựng một rào cản khuếch tán thích hợp. Việc xây dựng nhà máy khuếch tán khí K-25 khổng lồ đã được tiến hành trước khi một rào chắn phù hợp có sẵn với số lượng vào năm 1944. Như một sự sao lưu, Urey đã khuếch tán nhiệt.

Bị mòn mỏi bởi nỗ lực này, Urey rời dự án vào tháng 2 năm 1945, giao trách nhiệm cho R. H. Crist. Nhà máy K-25 bắt đầu hoạt động vào tháng 3 năm 1945, và khi các lỗi đã được thực hiện, nhà máy hoạt động với hiệu quả đáng kinh ngạc và kinh tế. Trong một thời gian, uranium được đưa vào nhà máy khuếch tán nhiệt dạng lỏng S50, sau đó là khí K-25, và cuối cùng là nhà máy tách điện từ Y-12; nhưng ngay sau khi chiến tranh kết thúc, các nhà máy tách nhiệt và điện từ đã bị đóng cửa, và sự tách biệt chỉ được tiến hành bởi K-25. Cùng với cặp song sinh, K-27, được xây dựng vào năm 1946, nó đã trở thành nhà máy tách đồng vị chính trong giai đoạn sau chiến tranh. Đối với công trình của ông về Dự án Manhattan, ông Urey đã được Huân chương khen thưởng bởi Giám đốc dự án, Thiếu tướng Leslie R. Groves, Jr.